1．蛋白质分离的原理和方法
(1)分离蛋白质的原理
蛋白质特性的差异
(2)分离蛋白质的方法
①凝胶色谱法：
ⅰ概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
ⅱ凝胶
ⅲ原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。
②电泳：
ⅰ概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
ⅱ原理：
a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
ⅲ方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)缓冲溶液
①作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
②配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
2．蛋白质提取和分离的实验操作
(1)样品处理
①红细胞的洗涤：
ⅰ目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
ⅱ方法：
②血红蛋白的释放：
ⅰ目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
ⅱ过程：
③分离血红蛋白溶液：
将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。
(2)粗分离——透析
①过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
②目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。
③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
(3)纯化——凝胶色谱操作
①凝胶色谱柱的制作：
ⅰ取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
ⅱ柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
ⅲ柱顶制作：打孔→安装玻璃管。
ⅳ组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。
②凝胶色谱柱的装填：
ⅰ色谱柱固定于支架上。
ⅱ干凝胶的计算和称量。
ⅲ溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
ⅳ装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。
ⅴ洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。
③样品的加入和洗脱：
调整缓冲液面：与凝胶面平齐
↓
滴加透析样品：用量为1 mL
↓
样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层
↓
洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱
↓
收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集
(4)纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
